e-magazine - page 42

Food FocusThailand
OCTOBER 2015 42
Carotenoids thatare lesspolarwillmoveduring themobilephase
better and so will move a longer distance; for example, b-carotene
will move with the solvent front. Carotenoids which aremore polar
such as lutein will movemore slowly allowing for the separation of
each typeof carotenoidextract in the sample.After the solvent front
moves for a set time, then theTLC platewill be removed to find the
rateofflow (Rf)value foreachcarotenoidband thatoccurs,and these
will be comparedwith carotenoid standards.
TheAnalysisof theTypesandQuantitiesof
CarotenoidsusingHighPerformanceLiquid
Chromatography (HPLC)
Currently, HPLC is used to analyze carotenoids instead of TLC or
open column chromatography due to HPLC’s convenience, speed
and precision. Photodiode-array system detectors are used to be
able toview theUV /Visspectraduring themovementofsubstances.
IsolatingcarotenoidsbyHPLC isoftendonebyusingC-18andC-30
columns, separating by a reverse-phase chromatography system,
which canbe doneas follows.
1. Take carotenoid extract from a dried samplewhich has been
stored at –20°C. Dissolve it in 1ml of methanol.
2. Filter thecarotenoidsolution througha0.45micrometer nylon
filtermembrane using a 2ml syringe; filter into a brown 2ml sample
bottle.
3.Suction1ml of thecarotenoidsolution intoabottle for injecting
the sample into theHPLC equipment.
4. Place the brown bottle in its correct order in the sample rack,
and clearlywrite the sequence number of the sample.
5. Set the various parameters of theHPLC equipment, such as
time.
6. Prepare stand b-carotene by dissolving standard b-carotene
in petroleum ether. Find the concentration bymeasuring the optical
absorption (A450 ) with a spectrophotometer. Make a stock standard
solution and dilute it into 4 separate concentrations. Thenmeasure
A450 todetermine the concentrationof eachb-carotene concentrate.
Inject each concentrate into the HPLC equipment to find the area
under the curve of peak of standard carotenoid solution at each
concentration in order to create a standard curve graph of solution
concentrationwith theYaxis being area under the curve and theX
axis being the concentrationmeasured inmg/ml.
Purificationof CarotenoidsusingColumn
Chromatography
Column chromatography is commonly used in the purification of
natural organic substances in a sample. There are several types of
columnchromatography, and theuseof aparticular typewill depend
on the typeof adsorbent andcompounds that need tobeseparated.
โดยแคโรทีนอยด์ที่มีขั้ วน้อยจะเคลื่อนที่ไปกั บเฟสเคลื่อนที่ได้ดีกว่าจึงท�ำให้มีระยะ
ทางที่ไกลกว่ า เช่น เบต้าแคโรทีน (b-carotene) จะเคลื่อนที่ไปกับตัวท�ำละลายเคลื่ อนที่
(Solvent front) ส่วนแคโรทีนอยด์ที่มีขั้ วมากกว่า เช่นลูทีน (Lutein) จะเคลื่อนที่ได้ช้ ากว่า
ท�ำให้ เกิดการแยกกั นของแคโรทีนอยด์แต่ ละชนิ ดในสารสกั ดตั วอย่ างได้ และ
เมื่อสารละลายเคลื่อนที่ได้สักระยะหนึ่งจึงน�ำแผ่นTLCออกมาแล้วหาค่าRf (Rateof flow)
ของแต่ละแถบแคโรทีนอยด์ที่เกิดขึ้ นเปรียบเทียบกับแคโรทีนอยด์มาตรฐาน
การวิเคราะห์ชนิดและปริ มาณของแคโรทีนอยด์ ด้วยวิธี
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
ในปัจจุบันHPLCได้ ถูกน� ำมาใช้ในงานวิ เคราะห์แคโรทีนอยด์แทนTLCและOpencolumn
chromatography เนื่องจากความสะดวก รวดเร็ ว และแม่นย�ำ โดยมีตัวชี้วั ด (Detector)
ชนิดPhotodiode-arraysystemถูกน�ำมาใช้เพื่อให้สามารถดู UV/VisSpectraในระหว่าง
การเคลื่อนที่ของสารได้ การแยกแคโรทีนอยด์ ด้วยHPLCมักใช้คอลัมน์ C-18และC-30
แยกด้วยระบบReverse-phasechromatography โดยสามารถท�ำได้ ดังนี้
1. น�ำสารสกัดแคโรทีนอยด์จากตัวอย่ างที่ถูกท�ำให้แห้งแล้วเก็บไว้ ที่อุณหภูมิ –20 ํC
มาละลายกลับด้วยเมธานอล (Methanol) ปริมาตร 1มิ ลลิลิตร
2. กรองสารละลายแคโรทีนอยด์ผ่านกระดาษกรอง (Nylon filtermembrane) ขนาด
0.45 ไมโครเมตร ใช้หลอดฉีดยา ขนาด 2 มิลลิลิตร กรองใส่ลงไปในขวดเก็บตัวอย่างสีชา
ขนาด2มิลลิลิตร
3. ดูดสารละลายแคโรทีนอยด์ปริมาตร 1มิลลิลิตร มาใส่ขวดเพื่อฉีดตัวอย่างส� ำหรับ
เครื่องHPLC
4. น�ำขวดสีชาไปว่ างเรียงกันในSample rack เขียนล�ำดับที่ ของตัวอย่างให้ ชัดเจน
5. ตั้งพารามิเตอร์ของเครื่องHPLCต่างๆ เช่น เวลา
6. เตรียมสารละลายมาตรฐานเบต้าแคโรทีน โดยการละลายสารละลายมาตรฐาน
ในปิโตรเลี ยมอี เทอร์ หาความเข้ มข้ นด้วยการวั ดค่าการดู ดกลืนแสง (A 450) ด้วย
เครื่องวั ดค่าการดู ดกลืนแสง (Spectrophotometer) เตรียมสารละลายมาตรฐาน (Stock
standard solution) ความเข้มข้นต่างๆ อีก 4 ความเข้ มข้น จากนั้นวัด A450 เพื่ อให้ทราบ
ความเข้มข้นของแบต้าแคโรทีนแต่ละความเข้มข้นแล้วน�ำมาฉีดHPLCหาพื้นที่ใต้กราฟ
ของพีคสารละลายแคโรทีนอยด์มาตรฐาน (Standard carotenoid) ที่แต่ละความเข้มข้น
เพื่อน�ำมาสร้างเป็ นกราฟสารละลายมาตรฐาน (Standardcurve) โดยให้แกนY เป็นพื้นที่
ใต้กราฟและแกนX เป็นความเข้มข้นหน่วยเป็นมิ ลลิกรัมต่อมิลลิลิตร
การแยกบริสุทธิ์แคโรทีนอยด์ด้ วยวิธี Column Chromatography
วิธีการแยกสารบริสุทธิ์ด้วยคอลัมน์โครมาโทกราฟี (Column chromatography) เป็นอีก
วิธีหนึ่งที่นิ ยมใช้ในการแยกบริสุทธิ์สารอิ นทรีย์ในตัวอย่างธรรมชาติ คอลัมน์ โครมาโท-
กราฟีมี หลายชนิดซึ่งจะขึ้นอยู่กับชนิดของตัวดูดซั บ (Adsorbent) และสารประกอบที่เรา
ต้องการแยก เช่น คอลัมน์โครมาโทกราฟีแบบดู ดซับ (Adsorption chromatography)